一般社団法人
日本細胞生物学会Japan Society for Cell Biology

slot lysis protocol

author後藤 聡
所属慶應義塾大学医学部生理学教室
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Published2011-11-14Last Update2011-11-14
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概要・原理

plasmid constructionの際、mini prepなしでinsertをもつ大腸菌を、安価に選択できる方法です。 大腸菌をmini prep用にseedし、薄く濁ってきたところで一部サンプリング、遠心してペレットにし、lysozyme入りのバッファーに懸濁した後、あらかじめアガロースゲルのウエルにアプライしておいたリシスバッファー上に重層して泳動します。Insertをもつプラスミドが入ったサンプルは、ベクターのサイズよりも大きくなるので、そのサンプルのみmini prepして、実際のinsertを確認することになり、手間が省けます。

装置・器具・試薬

  • 【試薬】 Protoplasting Buffer
  • 30 mM Tris pH8.0 1 M Tris-HCl (pH8.0) 30 ul
  • 5 mM EDTA 0.5 M EDTA 10 ul
  • 50 mM NaCl 5 M NaCl 10 ul
  • 20% sucrose Sucrose 0.2 g
  • 50 ug/ml RNase 10 mg /ml RNase 5 ul
  • 50 ug/ml lysozyme 10 mg /ml lysozyme 5 ul/ml
  • Lysis Buffer
  • 1 x TAE 10 x TAE 100 ul
  • 2% SDS SDS 20 mg
  • 5% Sucrose Sucrose 50 mg
  • BPB BPB 適/ml

詳細  *それぞれの写真をクリックすると拡大します。

    • 集菌  E.coliが薄く増えてきたら、100 ulを取って15,000 rpm 1min supをアスピレート
    • あらかじめ泳動槽にセットしたゲルに、2 ulのLysis Bufferをアプライ
    • E.coli pptに5 ulのProtoplasting Bufferを加えてsuspend、そのままLysis Bufferの上に重層 (protoplasting Bufferはあらかじめ分注してはだめ。一枚のゲル分を素早く処理すること)
    • 最低のvoltで15 min泳動後、100 Vに上げて適当な位置まで泳動する。

工夫とコツ

  • E.coliが育ちすぎると菌体のlysisがうまくいかず、泳動が汚くなるので、早めにサンプリングすること。

参考文献