オルガネラ局在タンパク質と蛍光タンパク質を融合させたコンストラクト（オルガネラマーカー）は、生細胞でもオルガネラの局在や構造を可視化できるため、オルガネラの経時的な変化を観察することが可能となる。当研究室では細胞骨格やエンドソーム、ミトコンドリアなどの12種類のオルガネラ局在タンパク質および局在配列と、群青色（Sirius）から近赤外色（iRFP713）までの6種類の蛍光タンパク質について、すべての組み合わせで発現プラスミドを作製し、その発現を確認した。自由記入欄にあるプラスミドはAddgeneから入手可能である（https://www.addgene.org/Yusuke_Ohba/）。

使用機器

35 mm glass base dish
CO2インキュベーター
蛍光顕微鏡

試薬

DMEM, high glucose (10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)
PEI MAX
OPTIMEM
DMEM/F12, no phenol red

1. 35 mm ガラスベースディッシュをtype I-C コラーゲンでコートする。
2. Cos-1細胞をまき、37℃ 5% CO2環境下に置く。※培養条件や細胞密度は細胞種に応じて変更する。
3. 翌日、オルガネラマーカー 1 µgをPEI MAXを用いてトランスフェクションし、37℃ 5% CO2環境下に置く。※トランスフェクション試薬は細胞種に応じて変更する。
4. トランスフェクションから約6時間後、培地を交換する。※培地交換の要不要は各試薬のプロトコルに従う。
5. 翌日から翌々日、培地をphenol red freeの培地に交換し、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察する【図１: 観察例】。

オルガネラマーカーは、オルガネラ局在タンパク質と蛍光タンパク質の組み合わせによって、目的のオルガネラ以外にも局在したり、オルガネラの構造を変えてしまうことがある。当研究室から提供しているプラスミドに関しては、Cos-1細胞およびHeLa細胞で局在を観察し、いくつかの組み合わせではmislocalizationが起こりやすいことを確かめている。こういった場合には組み合わせを変える他にも、原因となる塩基を特定して変異を入れるアプローチも有用である。例えばミトコンドリアマーカーについては、蛍光タンパク質のフォールディング効率を下げることでmislocalizationを抑えられる【参考文献】。

オルガネラマーカーの中には発現量が高くなるほどmislocalizationが起こりやすくなるものもあるため、初めて用いるマーカーについてはトランスフェクション量の検討を推奨する。参考文献において近赤外色蛍光タンパク質として用いたiRFP713は、オルガネラ局在タンパク質との組み合わせによって、細胞内に針状の構造を形成することがある【図2: iRFP-Rab5】。

S. Kashiwagi, Y. Fujioka, A.O. Satoh, A. Yoshida, M. Fujioka, P. Nepal, A. Tsuzuki, O. Aoki, S. Paudel, H. Sasajima and Y. Ohba. 2019. Folding Latency of Fluorescent Proteins Affects the Mitochondrial Localization of Fusion Proteins. Cell. Struct. Funct., 44: 183-194.